Drugim Oddziałem Muzeum Narodowego w Krakowie jest dom rodzinny najwybitniejszego polskiego malarza historycznego, Jana Matejki (1838-1893). Pomysł utworzenia muzeum w domu artysty narodził się wkrótce po jego śmierci. Aby dostosować przestrzeń mieszkalną do celów wystawienniczych, na przełomie XIX i XX w., w budynku przeprowadzono prace adaptacyjne. Po ich zakończeniu, w czerwcu 1904 roku, Towarzystwo im. Jana Matejki przekazało dom biograficzny artysty na własność Radzie Miejskiej, oddając go pod zarząd Muzeum Narodowego w Krakowie.

Znajdująca się tu wystawa prezentuje twórczość artysty począwszy od prac młodzieńczych aż po obrazy z ostatnich lat życia. Są też świadectwa wysokiej oceny twórczości mistrza m.in. dyplomy i nagrody oraz bogata dokumentacja dotycząca jego życia rodzinnego. Ciekawy jest również zbiór rzemiosła artystycznego i militariów, gromadzony przez Matejkę, wykorzystywany przez niego w postaci rekwizytów do kompozycji malarskich.